産業技術総合研究所(産総研)は6月11日、韓国・釜山大学との共同研究により、ダイズなどの農作物の害虫として知られる「ホソヘリカメムシ」の成長や繁殖に有益な影響を与える腸内共生細菌の「バークホルデリア」が、ポリエステルである「ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)」を宿主と共生している時に「細胞内顆粒」として蓄積すること、その細胞内ポリエステルの蓄積が正常な共生関係の維持に必要なことを明らかにしたと発表した。

成果は、産総研 生物プロセス研究部門の深津武馬首席研究員(兼・生物共生進化機構研究チーム 研究チーム長)、同・環境生物機能開発研究チームの菊池義智主任研究員、釜山大学のLee Bok Luel教授らの国際共同研究チームによるもの。研究の詳細な内容は、日本時間6月11日付けで米科学雑誌「米科学アカデミー紀要(PNAS)」に掲載された。

多くの昆虫類において共生細菌は自由生活相をもたないが、ホソヘリカメムシ(学名:Riptortus pedestris)では、土壌環境中のバークホルデリア(学名:Burkholderia sp.)が幼虫期に獲得され、腸内共生細菌として消化管の後端部にある共生器官に局在して、成長の促進、体サイズの増大、産卵数の増加といった有益な影響をもたらす。また、バークホルデリアは土壌環境中でも生活していることを反映して、簡単に培養でき、遺伝子操作も可能だ。そのため、ホソヘリカメムシとバークホルデリアは、共生に関わる分子機構解明のための有用なモデル実験系として活用されている(画像1～3)。

画像1(左):ホソヘリカメムシ。画像2(中):消化管の後端部(黄矢印)の共生器官。画像3(右):共生器官の内腔に細胞内PHA顆粒(赤矢頭)を蓄積した共生細菌が局在する

研究チームはまず、ホソヘリカメムシとバークホルデリアの共生関係に関わる分子を明らかにする目的で宿主の共生器官中に含まれるバークホルデリアを取り出し、そこから抽出したタンパク質と単離培養したバークホルデリアから抽出したタンパク質の比較を実施。その結果、共生状態で多量に発現しているタンパク質が同定された(画像4・A)。そしてアミノ酸配列が決定され、細菌の細胞内貯蔵ポリエステルであるPHA顆粒に結合する「PhaPタンパク質であることが判明したのである。これは、共生状態でPHA顆粒が蓄積していることを示している。

電子顕微鏡や蛍光染色による観察でも、共生状態のバークホルデリアの細胞内にはPHA顆粒が発達していたのに対し(画像5・B)、培養状態のバークホルデリアではPHA顆粒が未発達であった(画像5・C)。

画像4(左):(A)共生状態と培養状態の共生細菌に含まれるタンパク質の比較。共生状態でのみ多量に発現する分子量約1万9000のタンパク質が見える(黒矢頭)。画像5(右):(B)共生状態の共生細菌の電子顕微鏡像。PHA顆粒はよく発達する(赤矢頭)。(C)培養状態の共生細菌の電子顕微鏡像。PHA顆粒は未発達である(赤矢頭)

細菌の細胞内において、PHAは3段階の酵素反応(それぞれPhaA、PhaB、PhaCタンパク質が触媒となる)により合成される(画像6)。それらの内、PhaBタンパク質をコードするphaB遺伝子とPhaCタンパク質をコードするphaC遺伝子をそれぞれ破壊されたバークホルデリア系統が作成されて、野生型のバークホルデリア系統やPHA顆粒に結合するがPHA合成には関与しないPhaPタンパク質をコードするphaP遺伝子が破壊されたバークホルデリア系統と共に、それぞれ宿主カメムシに感染させられた(画像7)。

画像6。PHAの合成経路

画像7。バークホルデリア感染試験の実験デザイン

すると野生型系統とphaP破壊系統は宿主の腸内に正常に定着して高密度に増殖し、その細胞内にPHA顆粒を蓄積したのに対し(画像8・10)、phaB破壊系統とphaC破壊系統はPHA顆粒をほとんど蓄積せず、宿主の腸内における感染密度も著しく低かった(画像9・10)。

画像8(左):(A)・(B)野生型のバークホルデリア系統の電子顕微鏡像。赤矢頭はPHA顆粒を示す。画像9(中):(C)・(D)PHA関連遺伝子を破壊したバークホルデリア系統の電子顕微鏡像。画像10(右):野生型のバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊したバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊後再導入したバークホルデリア系統の宿主体内における感染量の比較

また、phaB破壊系統とphaC破壊系統に感染した宿主では、野生型系統やphaP破壊系統に感染した宿主に比べると共生器官の発達が明らかに劣っており(画像11)、体サイズも減少していたのである。

次に、正常なphaB遺伝子やphaC遺伝子をプラスミドに組み込んで、これらの遺伝子が破壊されたバークホルデリア系統に再度導入し、phaB再導入系統とphaC再導入系統が作成された。さらに、野生型系統にプラスミドのみが導入された系統とphaP遺伝子が再導入された系統と共に、それぞれ宿主カメムシに感染がなされた。

するとphaB再導入系統とphaC再導入系統では、細胞内のPHA顆粒蓄積、宿主の腸内における感染密度、宿主の共生器官の発達の度合い、宿主の体サイズがすべて、野生型系統やphaP再導入系統とほぼ同等にまで回復したのである(画像12・13)。

画像11(左):野生型のバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊したバークホルデリア系統に感染した宿主の共生器官の外観。画像12(中):PHA関連遺伝子を破壊後再導入したバークホルデリア系統に感染した宿主の共生器官の外観。共生細菌の感染密度が高いと膨満して白っぽく見える。画像13(右):野生型のバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊したバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊後再導入したバークホルデリア系統に感染した宿主雌成虫の体重

PHA顆粒が共生関係に必要とされる理由として有力なのは、以下のような「共生ストレス耐性仮説」だ。共生バークホルデリアは高密度で共生しており、宿主体内での増殖速度は遅い。宿主カメムシの寿命である約2カ月間、共生バークホルデリアは、高密度の共生状態や宿主の免疫系などによる制御の下でストレス環境に置かれている可能性があり、PHA顆粒の蓄積は共生バークホルデリアにストレス耐性を与えていると予想されるという。

実際に環境ストレスの下でバークホルデリアを培養すると、phaB破壊系統とphaC破壊系統のバークホルデリアは環境ストレスに弱く、一方でphaB再導入系統およびphaC再導入系統のバークホルデリアでは環境ストレス耐性が回復していることが確認された(画像14～16)。

野生型のバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊したバークホルデリア系統、PHA関連遺伝子を破壊後再導入したバークホルデリア系統のストレス条件下における生存率。画像14(左):リン酸緩衝液中に2日間(飢餓)。画像15(中):45℃の湯浴を10分間(熱ショック)。画像16(右):1モルのブドウ糖溶液中に24時間(高浸透圧)。

研究チームは今後、ホソヘリカメムシとバークホルデリアの共生関係の成立と維持にどのような形でPHAが関わっているのかについて、共生ストレス要因の絞り込み、網羅的発現遺伝子解析と機能解析、共生関連とPHA蓄積関連の遺伝子の同定と解析を通して、より詳細な解明を目指すとする。

また今回の結果から、共生能力あるいは宿主体内における高密度共生状態に耐える能力に、PHA蓄積が関係するらしいことがわかり、PHA合成系の導入や強化により、ほかの細菌、特にプロバイオティクスなどに用いられる腸内細菌において、宿主体内における安定性の向上に利用できる可能性も考えられるという。研究チームは、そのような観点からの技術開発にも取り組んでいくとしている。